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VIRUS FITOPATOGENOS
 
Objetivos :
  • Reconocer y describir síntomas típicos de virosis en muestras en fresco. 
  • Familiarizarse con algunas técnicas utilizadas en la detección e identificación de virus fitopatógenos.
 

Metodología :                 TRABAJO GRUPAL

 

 Bibliografía :  GEPP, V. 1996. Virus y viroides fitopatógenos. Facultad de Agronomía. Montevideo.  27p.

 

PARTE A

MESA I. SINTOMAS DE ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR VIRUS:

1. Observe los síntomas de las muestras en fresco, indicando su ubicación en la planta.

2. Describa un caso de los vistos.

Se presenta a continuación  una serie de fotografías de síntomas comunes en enfermedades provocados por virus.


Mosaico en hojas de Poroto de Manteca. Mosaico en Hojas de Manzano. Mosaico en hojas de Poroto Frutilla.

Mosaicos en hojas de cebada Mosaicos en hojas de lechuga Anillos cloróticos en hojas de Morrón.

Anillos cloróticos en hoja de malvón Mosaico en hojas de Abutilon Deformaciones en hojas de Boniato

Árbol de citrus de menor tamaño como consecuencia de estar afectado por el viroide de la Exocortis Enanismo en planta de papa. Compárese con la planta normal de la izquierda. Listado en planta de cebada.

Fasciación en sarmiento de Vid Enrollamiento de las hojas en papa provocado por el PLRV. Anillos en frutos de tomate provocados por el virus de la Peste Negra.

3. ¿cuáles son los síntomas más comunes de virosis en plantas?

Se recomiendan las siguientes páginas para ver síntomas de enfermedades causados por virus:
http://plantpath.unl.edu/peartree/homer/disease.skp/taxons/viral.html
Diferentes síntomas de virus en rosales: http://www.ianr.unl.edu/pubs/plantdisease/g980.htm

 

MESA II. TECNICAS DE DETECCION/IDENTIFICACIÓN.

Esta mesa presenta las principales técnicas utilizadas en virología vegetal, con el objetivo de conocer su utilidad y contribuir al análisis de los problemas del presente práctico.

Analice los siguientes puntos:

  • equipamiento necesario,
  • tiempo en que se obtienen los resultados,
  • simplicidad,
  • información que aporta (especificidad, presición, etc.),
  • que es lo que detecta del virus (o del viroide).

 

PLANTAS INDICADORAS :
 
   Ud. asesora productores hortícolas y observa en plantas de tomate los síntomas de la foto.
    De acuerdo con la literatura consultada, considera que puede ser una enfermedad virósica causada por uno de dos virus: TMV o CMV. No dispone de antisueros ni de laboratorio pero sí puede inocular las plantas que se indican en el cuadro siguiente.

Síntomas en plantas indicadoras de virus transmitidos en forma mecánica.

Chenopodium quinoa Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Phaseolus vulgaris Vigna sinensis
TMV Lesiones locales Lesiones locales Lesiones locales No susceptible Planta de C. quinoa
CMV Lesiones locales Asintomática o lesiones necróticas o cloróticas; mosaico sistémico Lesiones locales Lesiones locales

4. De acuerdo a las descripciones de los síntomas en plantas indicadoras ¿cuál(es) de ellas inocularía en el presente caso? ¿Por qué?

5. ¿Qué características deberían tener las plantas a ser inoculadas?
 
Observe estas plantas prontas para inocular:

MICROSCOPIA ELECTRONICA :

La siguiente figura es una fotografía al microscopio electrónico de savia de cebada con el virus del enanismo amarillo (BYDV). Por el tipo de tinción utilizado (tinción negativa) lo que aparece más oscuro es la capa de sustancia que rodea a las partículas. Los virus en sí aparecen de color claro. La barra indica una longitud de 100 nanómetros.
Compare el virus de la fotografía con los esquemas de géneros de virus de la figura 4 en la página 8 de GEPP, V. 1996. Virus y viroides fitopatógenos.

6. ¿A cual de los siguientes géneros de virus podría pertenecer el BYDV :  Closterovirus,  Potyvirus,  Luteovirus o Tospovirus?   ¿Qué características usó para contestar ?

7.  ¿Hubiera podido diferenciar un luteovirus de un cucumovirus en el microscopio electrónico ? ¿Por qué?

Para ver otras figuras de virus:
http://www.plantpath.wisc.edu/pp300/docs/virus.html
http://www.bocklabs.wisc.edu/EMGIFs.html
http://www.ppws.vt.edu/~sforza/tmv/tmv.html
 

SEROLOGIA :

Para realizar una prueba serológica se requiere disponer de un antisuero específico para lo que se quiere detectar (por ejemplo: Barley Yellow Dwarf Luteovirus, género Potyvirus o razas severas de Citrus Tristeza Closterovirus). Observe los catálogos disponibles en la clase práctica o entre en alguna de las siguientes direcciones de Internet:
http://www.ipo.dlo.nl/ipowww/dps/antisera/antisera.html
http://www.agrobiologicals.com/glossary/G1618.htm
http://www.agdia.com/catalog/
Y conteste las siguientes preguntas:
8. ¿Para qué tipos de patógenos hay antisueros disponibles?  ¿Para cuál hay mayor número?
9. ¿Cuál es su opinón sobre la razón de que haya más antisueros disponibles para este grupo de patógenos?

La prueba denominada Enzyme Linked Immunoassay (ELISA) se realiza en 4 etapas, entre las cuales se procede a lavar la placa para eliminar todas las moléculas no fijadas a las paredes de la misma. Para observar un esquema animado de la prueba, se recomienda entrar en la página web:   http://www.ppws.vt.edu/~sforza/tmv/elisa.html

Abajo se observa una fotografía de una placa de ELISA al final de la prueba y los resultados de la lectura de la absorbancia a 410 nanómetros de la misma placa.
Niveles de absorbancia con filtro de 410 nm (amarillo)
Placa de ELISA

10. ¿ En qué hoyos se colocó savia con mayor concentración de virus? ¿En qué se basó para contestar?

11. ¿Se puede afirmar que las plantas que no dieron una reacción en esta prueba estaban sanas? ¿Por qué?
 

HIBRIDACION MOLECULAR :

La metodología utilizada fue la siguiente:
Se maceraron plantas a testar y testigos sanos y enfermos. Se colocó una gota de cada planta en un lugar predeterminado de una membrana de nitrocelulosa. Luego de fijarlos se  incubaron con una sonda de ADN marcado con P32, y  se obtuvo una autoradiografía de la reacción. Observe el resultado.

12. ¿Cuál(es) de las plantas a testar contenían el virus en cuestión? ¿Cómo lo determinó?
 
1. macerado de planta sana
3. macerado de planta a testar
5. macerado de planta a testar
7. macerado de planta a testar
2. macerado de planta sana 
4. macerado de planta a testar
6. macerado de planta a testar
8. macerado de planta infectada con el virus

13. ¿Se puede afirmar que las plantas que no dieron una reacción en esta prueba estaban sanas? ¿Por qué?
 

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) :

Es una técnica que consigue amplificar trazas de ADN presentes en un muestra hasta niveles detectables, mediante la repetición de ciclos en un equipo llamado termociclador. En cada uno de estos ciclos se duplica una sección determinada (siempre la misma) del ADN total.

Desde 1994 en Fitopatología se está estudiando una enfermedad importante en la producción de duraznos denominada podredumbre morena. La bibliografía cita tres especies de hongos del género Monilinia como agentes causales esta enfermedad. Interesa saber cuál(es) de estas especies está(n) presentes en el Uruguay porque difieren en características como el rango de huéspedes y entre ellas hay especies cuarentenarias para otros países. Entre otros estudios, se están identificando las especies de Monilinia presentes mediante PCR con primers específicos, realizado sobre  muestras de órganos afectados recolectados en la zona productora.  Luego del PCR se realiza una corrida de electroforesis de las muestras.
 
La foto muestra el resultado en un gel de electroforesis, donde se observan las bandas correspondientes a:
  1     2     3    4    5   6     7     8    9    10
1. una mezcla de moléculas de ADN de tamaños conocidos,
2. Monilinia frutigena   (de colección),
3. Monilinia laxa  (de colección),
4. Monilinia fruticola  (de colección),
5 - 10. ADN de las muestras uruguayas.

14. ¿Qué conclusiones saca de esta prueba?

15. ¿Para qué factores patogénicos sirve el PCR?
 

COMPARACIÓN DE TÉCNICAS

16. Compare las 5 técnicas mencionados en el cuadro siguiente en relación con las características indicadas.
Considere 4 niveles, de +  (bajo) a  ++++  (muy alto).
 
Características:
Inoculación de plantas indicadoras
Microscopía electrónica
Serología
Hibridación de ácidos nucleicos
PCR
sensibilidad
         
repetibilidad
         
rapidez
         
sencillez
         
costo
         
adaptado a muchas muestras
         

Ayuda para llenar el cuadro.

17. ¿Cuál de estas técnicas no sirve para diferenciar virus dentro de un mismo género?

18. ¿En cuál de las técnicas sería más grave la contaminación de una muestra sana con algunas partículas de virus?

Más información:
En esta pagina se encontrarán descripciones de muchos de los términos técnicos empleados en el campo de las biotecnologia:
http://infobiochip.isciii.es/guia/glosario/glosario.htm

PARTE B

Discuta los cuatro ejercicios, teniendo en cuenta:

  1. el objetivo del técnico o investigador
  2. conceptos de sintomatología y diagnóstico
  3. conceptos de técnicas de detección e identificación de virus

 

EJERCICIOS

Ejercicio 1.-

El ajo es un cultivo que se propaga en forma vegetativa (se utiliza como semilla los dientes que forman el bulbo). Los virus constituyen un problema importante ya que pueden acumularse en las plantas generación tras generación y producir importantes pérdidas en el rendimiento.

Mediante la técnica de cultivo de meristemo es posible obtener clones de plantas libres de virus. Generalmente se obtienen unas pocas plantas (plantas madre) que se multiplican durante algún tiempo en áreas medianamente protegidas de los vectores de virus (pulgones, nematodos, etc) hasta obtener un número importante de bulbos de alta calidad sanitaria para comercializar.

Si Uds. estuvieran a cargo de un programa de saneamiento de ajo semilla:

a) ¿Que pasos seguirían para asegurarse que las plantas madre realmente esten libres de todos los virus importantes en el país?
b) ¿Utilizaría el mismo procedimiento en los cultivos de multiplicación?

Ejercicio 2.-

La papa se propaga en forma vegetativa. Se utiliza como "semilla" tubérculos enteros o fraccionados. PVY y PVX son dos virus mundialmente difundidos que infectan papa y otras solanáceas cultivadas o espontáneas.
Las plantas de papa afectadas por estos virus quedan enanas, arosetadas, y un mosaico más o menos visible. La producción de tubérculos es reducida en mayor o menor medida según el o los virus presentes y el cultivar.
En Uruguay, para la siembra de otoño, generalmente se importa la mayor parte de la papa semilla desde Canadá, la que se planta inmediatamente a su llegada. El MGAP exige que los lotes no contengan mas de un 3% de tubérculos afectados por virus en general, ni más de 1% de PVY.

a) ¿Qué técnica de detección/identificación de virus consideran Uds. que se adecua mejor para detectar la presencia de estos virus en los lotes de semilla de papa que entran al país?. Justifique.

b) ¿Por qué no se exige 0% de infección?


Ejercicio 3.-

Tomato spotted wilt tospovirus (TSWV) e Impatiens spot necrotic tospovirus (ISNV) son dos virus del mismo género o grupo. Ambos son muy polífagos, afectan un número importante de plantas hortícolas, ornamentales, malezas y algunos frutales. Ocasionan síntomas diversos, que son compartidos con otro tipo de virus. Por otro lado, pueden variar con las condiciones ambientales, cultivares, prácticas de manejo, etc. En Uruguay, no se conoce la difusión que pueden tener ambos virus. Con ayuda del material que se les proporciona, establezcan que técnicas de identificación podrían ser útiles para:
a) reconocer la posible presencia de un tospovirus.
confirmar presencia de uno u otro virus.


Ejercicio 4.-

En la clínica de Diagnóstico de la Unidad de Fitopatología ingresaron plantas ornamentales procedentes de un vivero comercial. Ver formulario que se adjunta.
El técnico responsable de procesar la muestra, sospecha que los síntomas observados se deben a problemas nutricionales o presencia de Tobacco mosaic tobamovirus (TMV).

a) Plantear alguna alternativa que le permita al técnico confirmar o descartar la hipótesis planteada.


Para contestar esta pregunta, tenga en cuenta que el costo de un diagnóstico es de aprox. $U 200 por muestra procesada.

 

PARTE C.

 
Redondeo final con presentación de lo analizado en cada ejercicio

 

EJERCICIO PARA EL TEORICO-PRACTICO

FORMAS DE TRANSMISION

2. ¿Cómo se clasifica la transmisión de virus por vectores?

Analice el siguiente experimento de transmisión de BYDV.
 
1. Cría de pulgones sobre plantas sanas.
2. Pulgones alimentándose de suspensión de virus más azúcar (1 día). 
3. Pulgones virulíferos sobre plantas sanas en jaulas individuales (4 días).
4. Plantas con síntomas luego de 20 días.

3. ¿A qué tipo de transmisión se ajusta la metodología usada para transmitir el BYDV? Fundamente.


Preguntas complementarias


¿Qué síntomas más comunes presentan las enfermedades virósicas de plantas?

¿Qué signo presentan las enfermedades virósicas?

¿En base a qué características se identifican los virus fitopatógenos?

¿Cuáles son las formas de transmisión de los virus fitopatógenos?

¿Qué tipo de vectores pueden transmitir virus entre plantas y cuál considera más importante?

¿Qué entiende por transmisión persistente y qué por transmisión no persistente de un virus a través de pulgones?

¿Qué importancia práctica tiene para el control de una enfermedad virósica de un cultivo anual el conocer si es transmitido en forma persistente o no persistente por los pulgones?

¿Qué es una planta indicadora y que características debe reunir?

¿Qué es la termoterapia y que utilidad presenta?

¿En que etapa de un cultivo llevaría a cabo el control de enfermedades virósicas?

¿Qué entiende por cultivo de meristemas? ¿Se puede afirmar que una planta producida por esta metodología está libre de virus?

¿Qué técnicas usaría para determinar la proporción de plantas infectadas por virus en los siguientes casos?.

a).- plantas de un cultivar que muestra síntomas evidentes de la enfermedad.

b).- un cultivar en la que se produce una infección latente.

c).- si las condiciones ambientales enmascaran los síntomas.

¿En condiciones naturales los virus fitopatógenos generalmente producen infecciones localizadas o sistémicas? Discuta el efecto que puede tener esto sobre las posibilidades de transmisión de virus a campo.

Para cada una de las formas de transmisión de virus que Ud. conoce, indique:

a).- La distribución en el campo de las plantas infectadas que Ud. esperaría observar. Considere un cultivo anual sembrado en líneas.

b).- ¿Qué medidas podrían tomarse para disminuir la transmisión?
 
 

Problemas

1.- En un cultivo de papa se detectaron plantas de menor tamaño que las demás y con síntomas de mosaico. Se llevaron muestras a un laboratorio donde se inocularon hospedantes diferenciales con el macerado de hojas enfermas. Se obtuvieron los siguientes resultados:
Chenopodium amaranticolor: lesiones locales en forma de pequeñas manchas de color amarillento a castaño claro.
Nicotiana debneyi y N.tabacum: aclaramiento de nervaduras en hojas superiores, seguido por mosaico internerval.

Al microscopio electrónico se observaron partículas flexuosas de 730 nm X 10 nm en el macerado.

Se realizaron una serie de pruebas, obteniéndose los siguientes valores:
- punto de inactivación termal: 55 - 65?C
- punto final de dilución: 10-1-10-2
- longevidad in vitro: 48 horas

a).- Con los datos del Manual de Prácticas (p. 35 y siguientes) determine cual es el virus. Fundamente su respuesta.

b).- El PVY es un virus con un amplio rango de hospedantes, tanto cultivadas como malezas. Indique cómo pueden haberse infectado las plantas de papa mencionadas arriba especificando fuente de inóculo y mecanismo de dispersión.

c).- ¿Es posible impedir la transmisión de este virus a través del uso de insecticidas sistémicos?. Fundamente.

d).- ¿Por qué son tan importantes las virosis en el cultivo de papa?
 
 

2.- En una zona se siembran distintos cultivares de poroto, en los cuáles se observó la siguiente sintomatología:
- En la mayoría de los cultivares, mosaico y abolladuras sistémicos y enanismo marcado.
- En el cultivar A, necrosis localizada en pequeñas áreas de los folíolos, no se hace sistémico.

Los síntomas aparecieron luego de una alta infestación de pulgones y principalmente en cultivos cercanos a praderas. Mediante la comparación de los síntomas con la bibliografía, los técnicos llegan a la conclusión de que es inducida por el virus del mosaico común del poroto.

a).- Mencione la técnica que elegiría para confirmar en forma rápida el diagnóstico primario realizado. ¿Qué limitante podría tener esta técnica?

b).- ¿Cómo considera que se dispersa el patógeno en el campo?

c).- ¿Donde sobreviviría el inóculo durante el invierno, cuando no se cultiva poroto?

d).- Explique a qué se podría deber la diferente sintomatología observada en el cultivar A?

e).- ¿Considera que el daño producido por esta enfermedad es similar en los distintos cultivares?

f).- ¿Qué posibilidades de éxito considera Ud. que tendría el control a través de cada una de las siguientes medidas? Fundamente.
- Uso de variedades resistentes.
- Rotaciones.
- Aplicación de insecticidas.
 
 

3.- En el cultivo de tomate se presenta una enfermedad que posee las siguientes características:

- mosaico en hojas, abolladuras y marcado enanismo.
- rango de hospedantes: distintas especies de solanáceas, cucurbitaceas y otras dicotiledóneas.
- no posee vectores eficientes
- se transmite con suma facilidad por contacto
- en el rastrojo puede sobrevivir hasta 3 años
- existen variedades con reacción de hipersensibilidad frente a este patógeno.
En base a estos datos conteste lo siguiente:

a).- ¿Cuál sería el factor patogénico responsable de la enfermedad?

b).- ¿Como esperaría que fuera la distribución de plantas afectadas en un cultivo sembrado en filas a 60 cm y con 10 cm entre plantas de una misma fila; en los siguientes momentos: pocos días después de la emergencia y al final del ciclo? Fundamente.

c).- Mencione y fundamente las medidas de control que recomendaría.

d).- ¿Qué importancia le asigna a las condiciones climáticas en el desarrollo de esta enfermedad?
 


Unidad de Fitopatología - fitopato@fagro.edu.uy