El siguiente artículo ha sido publicado en la revista: Horticultura Internacional Noviembre de 1999, Año 7, nº 26
CONTROL BIOLOGICO POSTCOSECHA EN URUGUAY
Silvana
Vero Méndez.Universidad
de la República, Facultad de
Química, Cátedra de Microbiología. Av. Gral. Flores
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Pedro Mondino. Universidad
de la República, Facultad de Agronomía, Cátedra
de Fitopatología. Unidad de Ecología y Protección
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PÉRDIDAS POSTCOSECHA EN FRUTAS. MÉTODOS DE CONTROL
Las enfermedades de postcosecha de frutas y hortalizas son una de las mayores causas de pérdidas en la producción de alimentos. Según estimaciones realizadas en EEUU estas pérdidas se sitúan en aproximadamente el 24% de las frutas y hortalizas cosechadas, mientras que en países subdesarrollados alcanzan valores muy superiores (Wilson et al 1994). En Chile se han estimado pérdidas postcosecha de incluso el 45-50% de la producción (Morales 1989). Estos valores están subestimados ya que generalmente se evalúa en un solo punto de la cadena que recorren los alimentos. Generalmente las mediciones se realizan en el momento de salida de cámaras pero existen pérdidas posteriores en los comercios, restoranes y en los hogares en donde se preparan finalmente los alimentos con esos productos (Wilson et al 1994).
Las causas de las pérdidas postcosecha son de orden fisiológico y patológico. Para controlar las enfermedades se recurre en general a cuidadosas prácticas de manejo de la fruta durante la cosecha y el almacenamiento. Por un lado se trata de minimizar la producción de heridas en los frutos ya que éstas constituyen la vía de entrada para la mayoría de los patógenos. Por otra parte mediante la sanitización de las plantas de empaque y envases se pretende reducir al máximo los niveles de inóculo. Sin embargo todas estas medidas no son suficientes para controlar el desarrollo de patógenos por lo que se recurre entonces a la aplicación de fungicidas sintéticos, mediante baños o por aspersión.
Existe un número reducido de principios activos disponibles para su uso como fungicidas en postcosecha lo que limita las posibilidades de realizar un manejo de los mismos que evite la selección de genotipos resistentes. Numerosos informes refieren la aparición de cepas de los patógenos resistentes a los principios activos utilizados en la postcosecha (Jones & Aldwinckle 1990, de los Santos et al 1990, Rosenberger & Meyer 1981, Latorre 1989). Por otro lado la aplicación de fungicidas postcosecha está siendo objeto de numerosas restricciones en varios países. Existe una fuerte presión por parte de los consumidores exigiendo la limitación del uso de estos productos por razones toxicológicas y ambientales (Wilson et al 1994).
Ya en el año 1987 un estudio realizado por la National Academy of Sciences (NAS) reportaba que 9 compuestos oncogénicos abarcaban el 90 % de todas las ventas de fungicidas. El mismo informe indicaba también que los fungicidas constituyen el 60% del riesgo de contraer cáncer de todos los pesticidas usados en los alimentos (Wilson & Wisniewski 1989).
Esto lleva a un proceso de eliminación progresiva de los fungicidas autorizados para su uso en la postcosecha. Se suma a esto la falta de nuevos principios activos que reemplacen a los anteriormente eliminados.
La situación descrita obliga a la investigación y desarrollo de métodos de control alternativos y/o complementarios al control químico (Wilson et al 1994).
Una alternativa es el control biológico.
CONTROL BIOLOGICO
En un sentido amplio y según la definición
de Cook y Baker el control biológico involucraría todas aquellas
prácticas tendientes a disminuir la incidencia de enfermedades excluyendo
el control químico. En este artículo nos referiremos al control
biológico en un sentido más restringido como el uso de microorganismos
antagonistas que interfieren en la supervivencia de patógenos o en
el desarrollo de actividades determinantes de enfermedad.
En la naturaleza existe una interacción continua entre los potenciales
patógenos y sus antagonistas de forma tal que estos últimos
contribuyen a que no haya enfermedad en la mayoría de los casos; es
decir, el control biológico funciona naturalmente. (Cook & Baker
1983) En condiciones naturales los microorganismos están en un equilibrio
dinámico en la superficie de las plantas. La disminución de
la flora de competencia por prácticas agrícolas como lavado
de frutos, aplicación de fungicidas, y desinfección de suelos
entre otras, favorecen el desarrollo de los patógenos (Rollán
et al 1998).
La existencia de flora saprofítica en la superficie de las frutas capaz
de controlar patógenos de postcosecha fue demostrada por Chalutz
y Wilson luego de observar que frutos de citrus que habían sido cuidadosamente
lavados con agua antes de ser almacenados presentaban mayor incidencia de
podredumbre que aquellos almacenados sin lavar (Chalutz & Wilson
1989).
Mecanismos mediante los cuales los antagonistas ejercen su acción.
No
es fácil determinar con precisión los mecanismos que intervienen
en las interacciones entre los antagonistas y los patógenos sobre la
planta o en las heridas. En general los antagonistas no tienen un único
modo de acción y la multiplicidad de modos de acción es una
característica a seleccionar en un antagonista. Esto se debe a que
los riesgos de seleccionar al patógeno por resistencia al antagonista
se reducen al actuar éste último por varios mecanismos.
El riesgo de resistencia se reduce también mediante el uso de combinaciones
de antagonistas de diferente modo de acción.
Se han descrito varios mecanismos de acción de los antagonistas para
controlar el desarrollo de patógenos sobre fruta. Ellos son: antibiosis,
competencia por espacio o por nutrientes, interacciones directas con el patógeno
(micoparasitismo, lisis enzimática), e inducción de resistencia
(Cook and Baker 1983).
Antibiosis
Se refiere a la producción por parte de un microorganismo de sustancias
tóxicas para otros microorganismos, las cuales actúan en bajas
concentraciones (menores a 10 ppm.). La antibiosis es el mecanismo de antagonismo
entre microorganismos más estudiado.
| Cultivo dual de Epicoccum nigrum y Sclerotinia sclerotiorum mostrando la inhibición por antibiosis. |  |
Es deseable que la antibiosis no sea el principal mecanismo de acción de un antagonista. Esto se debe a que, al igual que cuando se usan fungicidas sintéticos, existe el riesgo de aparición de cepas del patógeno resistentes al antibiótico. El antecedente más notorio ha sido el caso de la aparición de cepas de Agrobacterium tumesfaciens (causante de la agalla de corona de las plantas) resistentes al Agrosin 84, un antibiótico producido por una cepa de Agrobacterium radiobacter (Campbell 1989). La antibiosis a su vez genera rechazo por parte de consumidores quienes exigen se estudie la posible toxicidad u otro tipo de daño a la salud que estos compuestos pudiesen provocar. Se ha asimilado la antibiosis como mecanismo de control biológico al uso de agroquímicos, sin embargo sus defensores alegan que no se puede comparar la liberación de una sustancia a escala microbiana con el uso masivo de agroquímicos.
Competencia
Otro de los posibles mecanismos de acción antagónica es la competencia.
Se puede definir competencia como el desigual comportamiento de dos o más
organismos ante un mismo requerimiento, siempre y cuando la utilización
del mismo por uno de los organismos reduzca la cantidad disponible para los
demás. Un factor esencial para que exista competencia es que haya "escasez"
de un elemento, si hay exceso no hay competencia. La competencia más
común es por nutrientes, oxígeno o espacio.
| Inhibición de Phytium por Pseudomonas fluorescens en un medio con falta de Fe. Esta inhibición no ocurre cuando al medio se agrega Fe. |  |
Botrytis cinerea
y Penicillium expansum son dos hongos de postcosecha típicamente
dependientes de los nutrientes. Son hongos necrotróficos y sus esporas
requieren de nutrientes exógenos para poder germinar y comenzar el
crecimiento de las hifas antes de penetrar al sustrato. Esos nutrientes
los encuentran en las heridas de las frutas y es allí donde la competencia
microbiana actúa inhibiendo el desarrollo de estos hongos. Droby
y colaboradores estudiaron el mecanismo de antagonismo de una cepa de Pichia
guillermondii cuando se aplica sobre heridas de pomelos para controlar
el ataque por Penicillium digitatum, en dicho trabajo concluyen
que la competencia por nutrientes es uno de los mecanismos mediante los cuales
se logra un efectivo control del patógeno en las heridas (Droby et
al. 1987).
La competencia por espacio también ha sido reportada; Wilson y colaboradores
mencionan que las levaduras son efectivas colonizadoras de la superficie de
plantas y destaca la producción de materiales extracelulares (en especial
polisacáridos) que restringen el espacio para la colonización
por otros microorganismos (Wilson et al 1996).
Interacción
directa con el patógeno
Existen dos tipos de interacciones directas entre los antagonistas y los patógenos.
Ellas son el parasitismo y la predación:
Parasitismo
El término parasitismo se refiere al hecho de que un microorganismo
parasite a otro. Puede ser definido como una simbiosis antagónica entre
organismos. El parasitismo consiste en la utilización del patógeno
como alimento por su antagonista. Generalmente se ven implicadas enzimas
extracelulares tales como quitinasas, celulasas, Beta-1-3-glucanasas y proteasas
que lisan las paredes de las hifas, conidios o esclerotos. (Melgarejo 1989,
Ulhoa 1996).
| Hifas de Trichoderma sp. envolviendo hifas de Rizopus sp |  |
Los ejemplos más conocidos de hongos hiperparásitos son Trichoderma y Gliocladium. Ambos ejercen su acción mediante varios mecanismos entre los que juega un rol importante el parasitismo. Hongos del género Trichoderma han sido muy estudiados como antagonistas de patógenos de suelos como Rizoctonia solani, Sclerotium rolfsii y Sclerotium cepivorum y existen varias formulaciones comerciales desarrolladas a partir de ellos (Fravel 1998).
Predación
En el caso de la predación el antagonista se alimenta de materia orgánica
entre la cual ocasionalmente se encuentra el patógeno. No ha sido un
mecanismo de acción muy importante en el desarrollo de agentes de biocontrol.
Los reportes más conocidos citan la presencia de amoebas en suelos
supresores de enfermedades las cuales se alimentan de las hifas de hongos
patógenos entre otras fuentes de alimento (Campbell 1989).
Inducción
de resistencia
Las plantas como otros seres vivos del planeta han pasado por un proceso evolutivo
desde su aparición sobre la tierra lo que les llevó a desarrollar
mecanismos de defensa muy poderosos contra sus invasores. De esta forma se
acostumbra a postular que la resistencia es la regla mientras que la susceptibilidad
es la excepción. Si elegimos una planta cualquiera y comparamos
el inmenso número de microorganismos que existe en su entorno sobre
la tierra con el limitado número de microorganismos patógenos
de ella debemos concluir que esto es así. Las plantas presentan
entonces mecanismos bioquímicos y físicos o estructurales de
resistencia. Todos ellos gobernados genéticamente.
Se puede inducir resistencia en productos cosechados mediante el uso de diferentes
inductores como bajas dosis de luz ultravioleta, compuestos naturales de las
plantas como quitosano (producto de la deacetilación de la quitina),
y también mediante el uso de microorganismos antagonistas. Se ha demostrado
que levaduras utilizadas para el biocontrol de patógenos de postcosecha
además de competir por espacio y nutrientes son capaces de inducir
resistencia en la planta. Tal es el caso de Pichia guillermondii (US-7),
la cual es ha mostrado ser inductora de la producción de fitoalexinas
en frutos cítricos (Wilson et al 1994).
CONTROL BIOLÓGICO DE ENFERMEDADES DE POSTCOSECHA.
La postcosecha presenta características propias
favorables al desarrollo y aplicación práctica de métodos
de Control Biológico. Se trata de un ambiente reducido, donde los antagonistas
pueden ser aplicados fácilmente sobre los frutos utilizando las mismas
instalaciones que se emplean para los tratamientos con fungicidas. Las condiciones
controladas del ambiente de almacenamiento permiten superar el mayor inconveniente
que ha tenido el desarrollo de productos biológicos, como lo es el
traslado de los resultados de laboratorio a las condiciones de campo.
En este caso las condiciones en que se realizan los ensayos de laboratorio
se aproximan mucho a las existentes en las cámaras, disminuyendo así
el número de fallos al pasar del laboratorio al campo. Según
Wilson y Wisniewski es fácil dominar a los patógenos con antagonistas
en el ambiente de postcosecha debido a que la biomasa que debemos proteger
se encuentra concentrada y en condiciones de ambiente controlado (Wilson &
Wisniewski 1992). Los productos cosechados tienen un alto valor agregado lo
que determina la viabilidad de métodos de control más elaborados
que no serían económicamente aplicables a campo (Wilson &
Wisniewski 1992).
Valdebenito-Sahuenza cita algunas de las características deseables
de un agente de biocontrol de enfermedades postcosecha en frutos. Ellas son:
a - no producir metabolitos tóxicos para el hombre u otros organismos
benéficos, b - no desarrollarse a la temperatura del cuerpo humano,
c - mantener constante la eficiencia de control, y d - tener gran
capacidad de multiplicación y utilización de substratos simples
y de bajo costo para una económica producción en gran
escala (Valdebenito-Sanhueza 1998).
En la actualidad existen en el mercado varias formulaciones comerciales para
control biológico de patógenos postcosecha en frutas. Algunas
de ellas pueden ser encontradas en la pagina web perteneciente al Biocontrol
Plant Diseases Laboratory (Fravel 1998). En dicha página web
se pueden encontrar 35 formulaciones comerciales sobre la base de bacterias,
levaduras u hongos filamentosos, destinados a controlar distintos patógenos
de plantas y este número se actualiza permanentemente.
EL CONTROL BIOLOGICO POSTCOSECHA EN URUGUAY
El Control Biológico de enfermedades de postcosecha
es una alternativa posible. Así lo ha demostrado el primer proyecto
desarrollado en Uruguay de Control Biológico de Enfermedades de Manzana
financiado por International Foundation for Science (IFS). En el marco del
mismo se han aislado microorganismos antagonistas de la superficie de frutos
de manzana Red Delicious provenientes de montes de manejo orgánico
y convencional. Se han seleccionado, identificado y caracterizado cepas de
bacterias y levaduras capaces de controlar el moho azul sobre heridas en frutos
de manzana. Se han estudiado los mecanismos mediante los cuales estos antagonistas
ejercen su acción y se han determinado las concentraciones óptimas
de aplicación.
Para la selección de microorganismos antagonistas se han realizado
ensayos de biocontrol del moho azul en heridas de manzanas. La determinación
de la capacidad antagónica de las cepas bacterianas y de levaduras
aisladas de manzanas se realizó de la siguiente manera: Se practicaron
4 heridas ecuatoriales en diez manzanas sanitizadas superficialmente. Dos
de las heridas se inocularon con una suspensión del antagonista en
suero fisiológico del orden de 108 ufc/ml. Las otras dos heridas, tomadas
como testigos, se inocularon solamente con suero fisiológico.
Después de 24 horas a 24ºC todas las heridas se inocularon con
suspensión de conidias de patógeno. Los frutos así
tratados fueron colocados en cajas de plástico con humedad a saturación
e incubadas a 24ºC o 5ºC. Luego del período de incubación
las heridas se examinaron y se registró presencia o ausencia de podredumbre
y se midieron los diámetros de las zonas afectadas. Se registraron
dos parámetros: Porcentaje de incidencia y porcentaje de severidad
definidos como:
% de incidencia =
número de heridas afectadas X 100
número de heridas totales
% de severidad =
DLA X 100
DLC
DLC= Diámetro promedio
de las lesiones de las heridas control
DLA= Diámetro promedio de las lesiones de las heridas tratadas
Diámetro de la lesión = Diámetro de la zona afectada
- diámetro de la herida.
En todos los casos la
incidencia de moho azul en las heridas control (sin antagonista) fue
del 100% mientras que en heridas tratadas con antagonistas se logró
evitar la aparición de los síntomas.
Las gráficas que acompañan al texto muestran los resultados
de los ensayos en fruto a 24ºC y a 5ºC.
| Ensayo de selección de antagonistas de acuerdo a su capacidad de controlar la podredumbre azul ocasionada por Penicillium expansum sobre heridas de manzana. |  |
Las tres cepas bacterianas
utilizadas (B. subtilis, B. pumilus y E. agglomerans)
produjeron inhibición del crecimiento del patógeno en placas
de cultivo dual, debido a la producción de sustancias antifúngicas.
A pesar de ello no resultaron buenos antagonistas en fruto. En algunos casos
la severidad de los síntomas fue mayor que en las heridas control.
Lo cual destaca la importancia de realizar los ensayos de biocontrol en el
verdadero sitio de acción.
La cepa (Candida sp) que dio mayor protección a ambas temperaturas
de incubación no pudo ser identificada a nivel de especie y además
su temperatura óptima de crecimiento fue de 37ºC (temperatura
del cuerpo humano). A pesar de su alta capacidad antagónica no será
tenida en cuenta hasta lograr su identificación precisa y descartar
cualquier posibilidad de que se trate de una especie patógena para
el ser humano.
Los antagonistas seleccionados fueron las cepas de levadura identificadas
como Cryptococcus laurentii y Candida ciferrii. Se demostró
que estas cepas no producen antibióticos y que compiten por los nutrientes
en las heridas de los frutos impidiendo la colonización de las mismas
por parte del patógeno. En ensayos posteriores se logró determinar
que el principal mecanismo de acción involucraba la competencia por
la fuente de nitrógeno presente en las heridas. Cepas de Cryptococcus
laurentii ya han sido descritas como agentes de biocontrol en postcosecha.
La cepa aislada en este trabajo tiene la particularidad de ser incapaz de
crecer a 37ºC lo cual aumenta su potencial bioseguridad como agente
de biocontrol.
En este momento se está realizando un ensayo en cámaras comerciales
con los dos antagonistas seleccionados. Se registrará la incidencia
de moho azul en frutos tratados con dichos antagonistas y se comparará
con la incidencia en frutos sin tratar y tratados con fungicidas sintéticos.
El resultado de este ensayo estará listo en el mes de diciembre. Trabajos
anteriores han mostrado concordancia entre los ensayos a nivel comercial y
de laboratorio, por lo cual es de esperar que se logre una reducción
de la incidencia de moho azul en los frutos tratados. Este trabajo es sólo
el inicio de una investigación para la obtención de una formulación
de aplicación a gran escala, que permita lograr una disminución
de la incidencia del moho azul en manzanas almacenadas en cámaras frigoríficas.
Incidencia y severidad de la podredumbre azul ocasionada por P. expansum en heridas de manzana inoculadas previamente con las diferentes cepas antagonistas (24ºC) El valor de 100% corresponde a la incidencia y severidad en las heridas inoculadas solamente con el patógeno. Barras con la misma letra no son significativamente diferentes (LSD, alfa = 0,05)
Incidencia y severidad
del ataque del patógeno a heridas de manzana en presencia de los diferentes
antagonistas (5ºC). El valor de 100% corresponde a la incidencia y severidad
en las heridas inoculadas solamente con el patógeno. Barras con la
misma letra no son significativamente diferentes (LSD, alfa = 0,05)
BIBLIOGRAFÍA
Campbell, R. 1989. Biological control of microbial plant pathogens. Cambridge University Press. Cambridge 218p.
Chalutz, E. and Wilson, C.L. 1989. Postharvest Biocontrol of Green and Blue Mold and Sour Rot of Citrus Fruit by Debaryomyces hansenii. Plant Disease 74, 134 - 137.
Cook, J.R. & Baker,
K.F. 1983. The nature and practice of biological control of plant pathogens.
St. Paul, Minnesota. APS Press 539p.
De los Santos, M., Martinez, A. y Rossini, M. 1990. Situación
de la Resistencia de Penicillium a Fungicidas Utilizados en Post-cosecha
de Manzana. Universidad de la República, Facultad de Agronomía.
Montevideo, Uruguay. Tesis de Ing. Agr.
Droby, S., Hofstein, R., Wilson, C., Wisniewski, M., Fridlender, B., Cohen, L., Weiss, B., Daus, A. & Chalutz, E. 1996 Pilot test of Pichia guillermondi: A biocontrol agent of pstharvest diseases of citrus fruit. Biological Control 3, 47-52.
Esterio, M., Auger, J., Alvarez, E. Droguett, A., Caro, V. y Maturana, G., 1998. Efecto en campo de los fungicidas mas utilizados en Chile en uva de mesa (Vitis vinifera L.) sobre Trichodex 25%WP. (Trichoderma harzianum Rifai,) resumen en Fitopatología 33:1 p.25
Fravel, Deborah, 1998. Commercial Biocontrol Products for Use against Soilborne Crop Diseases. Web site: http://www.barc.usda.gov/psi/bpdl/bpdlprod/bioprod.html
Jones ,A.L. & Aldwinckle, H.S. Eds. Compendium of Apple and Pear diseases. 1990. St paul Minnesota, APS Press. 100 p.
Latorre, Bernardo Ed. 1989. Fungicidas y nematicidas; avances y aplicabilidad. Santiago, Chile. Facultad de Agronomía. Pontificia Universidad Católica de Chile. 216p
Melgarejo, P., De Cal, A., et M.-Sagasta, E. 1989. Influence of Penicillium frecuentans and two of its antibiotics on production of stromata by Monilinia laxa in culture. Can. J. Bot. 67:83-87.
Morales, Antonio 1989. Fungicidas recomendados en postcosecha in Fungicidas y nematicidas; avances y aplicabilidad. Santiago, Chile. Facultad de Agronomía. Pontificia Universidad Católica de Chile. 113-124.
Rollán, M., Mónaco, C. Lampugnani, G. y Arteta, N. 1998. Variación de la población de hongos antagonistas de Sclerotinia sclerotiorum en el suelo por la aplicación de agroquímicos, p 27 en Primer congreso argentino de control biológico de enfermedades de plantas. Acta de resúmenes. Universidad de Buenos Aires, Secretaría de Agricultura, Ganadería y pesca. Buenos Aires, Argentina.
Rosenberger, D.A. and Meyer, F.W. 1981. Postharvest fungicides for apples: development of resistance to benomyl, vinoclozoline and iprodione. Plant Disease 65:1010 - 1013
Ulhoa, C.J. 1996. Enzimas micolíticas produzidas pelo agente de biocontrole Trichoderma harzianum. p.234-238 en V sincobiol Simposio de controle biológico. Anais: conferencias y palestras.Foz de Iguaçu-Parana-Brasil.
Valdebenito-Sanhueza, R.M. 1998. Control biológico de enfermedades de frutas en postcosecha. p. 56-57 en Primer congreso argentino de control biológico de enfermedades de las plantas. Acta de resúmenes. Buenos Aires, Universidad de Buenos Aires, Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca.
Wilson, C.L., Ghaouth, A., Chalutz, E., Droby, S., Stevens, C., Khan, V. and Arul, J. 1994. Potencial of induced Resistance to Control Postharvest Diseases of Fruits and Vegetables. Plant Disease 78:9 : 837 - 844
Wilson, Charles L. and Wisniewski, Michael E. 1989. Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables: an emerging technology. Annual Review Phytopathology 27:425 - 441
Wilson, C.L., Wisniewski, E., El-Ghaouth, A., Droby, S. And Chalutz, E. 1996. Comercialization of antagonistic yeasts for the biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables. SIM News, 46:5: 237-242.
Wilson, Charles L.; Wisniewski, Michael E. 1992. Futures alternatives to synthetic fungicides for the control of postharvest diseases p.133-138 en Bilogical Control Of Plant diseases, edited by E.S. Tjamos et al., Plenum Press, New York