Programa (Prácticos)

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Fecha de inicio:

Situación Problema 1.- Control biológico del tumbado de la lechuga ocasionado por Sclerotinia sclerotiorum.

Material de lectura: Ficha sobre enfermedades de plantas. Podredumbre blanda de la lechuga.

Objetivo 1: Aislamiento de microorganismos capaces de parasitar esclerotos

PROTOCOLO
Se recibirán esclerotos de Sclerotinia sclerotiorum que han sido incubados en distintas muestras de suelo por 10 días.

Día 1

Aislamiento:
a) Desinfectar superficialmente los esclerotos sumergiéndolos por 3 min. en una solución al 2 % de hipoclorito de sodio.
b) Lavar varias veces con agua estéril para remover el exceso de desinfectante
c) Incubar los esclerotos desinfectados sobre papel de filtro estéril en cámara húmeda, a 25ºC, hasta aparición de microorganismos colonizadores
d) Dividir asépticamente los esclerotos, colocarlos en placas de PDA e incubarlos a 25ºC para favorecer el desarrollo de microorganismos que hayan colonizado el interior de los mismos.

Día 2

Ailamiento cont.:
a) Observar los aislamientos obtenidos tratando de identificar si se trata de bacterias u hongos.
b) Realizar repiques a fin de obtener cultivos puros
c) Sembrar en placas de agar quitina

Día 3
Evaluación de resultados

a) Lectura y evaluación de resultados.
b) Ensayos de actividad antimicrobiana.

· Objetivo 2: Aislamiento de microorganismos capaces de inhibir el crecimiento de la forma micelial de Sclerotinia sclerotiorum en muestras de suelo.
·
PROTOCOLO
Se recibirán muestras de suelo de plantaciones de lechuga.

Día 1

Aislamientos de suelo:
a) Suspender 10 gramos de suelo en 90 ml de suero fisiológico estéril
b) Prepara diluciones 1/10 y 1/100 del anterior
c) Aislar en placa de :
- TSA
- PDA,
- Agar quitina,
- Agar con paredes de Sclerotinia como única fuente de carbono

d) Incubar a 25ºC

Día 2

Ensayos de selección:
a) Realizar ensayos de inhibición de crecimiento de Sclerotinia sobre troncos de repollo, con cepas obtenidas en el paso anterior. (ver anexo)
b) Realizar cultivos duales en placa de PDA

Día 3

Evaluación de resultados
a) Lectura y evaluación de resultados.
b) Ensayos de actividad antimicrobiana

Situación Problema 2.- Control biológico de la podredumbre azul del manzano ocasionada por Penicillium expansum.

Material de lectura: Ficha de enfermedades de plantas. Podredumbre azul del manzano.

Objetivo: Aislamiento de antagonistas de Penicillium expansum de la superficie de manzanas sanas

PROTOCOLO

Día 1
Aislamiento
Se recibirán manzanas recién cosechadas
a) Pelar asépticamente 2 manzanas
b) Colocar la cáscara en 200 ml de suero fisiológico estéril
c) Homogeinizar la muestra en Stomacher
d) Preparar las diluciones 1/10 y 1/100 de la anterior
e) Sembrar 0.1 ml de las tres suspenciones en Agar Jugo de Manzana
f) Incubar a 5ºC

Día 2
Selección y mecanismos de acción
La selección se realizará por ensayo de biocontrol en heridas de fruta
a) Lavar con detergente y enjuagar con agua la superficie de manzanas con el fin de remover restos de fungicida
b) Desinfectar superficialmente los frutos con etanol al 70%
c) Dejarlos secar y realizar heridas puntuales en la zona ecuatorial de los frutos
d) Preparar suspensiones en suero fisiológico estéril de los microorganismos a estudiar, de forma de alcanzar una concentración del orden de 107 microorganismos/ml
e) Inocular tres de las heridas con 10 microlitros de la suspensión del antagonista
f) Inocular la herida control con 10 microlitros de suero fisiológico estéril.
g) Incubar en frío.
h) Pasadas 24 horas inocular con 10 microlitros se suspensión de conidias de Penicillium expansum de concentración 104 conidias/ml. Continuar incubación
· Mecanismos de acción
a) Sembrar los aislamientos en agar quitina
b) Realizar cultivo dual en medio con y sin hierro para determinar inhibición por sideróforos
c) Sembrar aislamientos en medio CAS para verificar producción de sideróforos

Día 3

Evaluación de resultados
a) Lectura y evaluación de resultados.
b) Ensayos de actividad antimicrobiana

Situación Problema 3.- Control biológico del marchitamiento vascular del tomate ocasionado por Fusarium oxysporum f.sp lycopersici .

Material de lectura: Ficha de enfermedades de plantas. Marchitamiento vascular del tomate ocasionado por Fusarium oxysporum f.sp lycopersici .

Objetivo: Aislamiento de microorganismos de la rizosfera, rizoplano y endófitos capaces de controlar el Fusarium en plantines de tomate

PROTOCOLO

Día 1

Aislamiento
Se recibirán plantines de tomate
a) Aislamiento de rizosfera: Suspender 1 gramo de suelo rizosférico en 9 ml de suero fisiológico estéril
Preparar las diluciones 1/100, 1/1000 y 1/10000 ( 10-2, 10-3, 10-4) de la suspensión anterior
Sembrar 0.1 ml de las suspensiones en placas de TSA, R2A y PDA con cloramfenicol. Incubar a 25ºC.
b) Aislamiento de rizoplano: Lavar las raíces de los plantines en suero fisiológico con Tween (0.1%) para remover el exceso de tierra. Enjuagar en suero fisiológico. Colocar las raíces en frascos con suero fisiológico y agitar en agitador mecánico por 1 hora o sonicar por 30 segundos. Preparar las diluciones 1/10 y 1/100 de la suspensión anterior y sembrar 0.1ml en placas de TSA, R2A y PDA con cloramfenicol. Incubar a 25ºC.
c) Aislamiento de endófitos: Desinfectar superficialmente las ríaces de plantines sumergiéndolas 4 min. en hipoclorito de sodio al 0.1%. Enjuagar con suero fisiológico estéril. Moler la muestra en mortero esterilizado y retomar con suero fisiológico estéril. Sembrar 0.1 ml de la suspensión obtenida en TSA, R2A y PDA con cloramfenicol. Incubar a 25ºC.

Día 2

Selección
a)Ensayo de colonización de raíces de plantines de tomate.
- Preparar una suspensión del microorganismo a ensayar de forma de lograr una concentración de 108 ufc/ml .
- Sumergir semillas de tomate en esa suspensión un tiempo de 2 a 24 horas.
- Colocar las semillas en tubo conteniendo agar agua al 0.8% y esperar que la raíz se forme.
b) Realizar cultivos duales de los microorganismos a ensayar con Fusarium oxysporum
c) Sembrar microorganismos en agar quitina
d) Sembrar en medio CAS para determinar producción de sideróforos

Día 3

a) Lectura y evaluación de resultados.
c) Ensayos de actividad antimicrobiana

Objetivo: Presentación de técnicas para detectar actividad antimicrobiana de sustancias naturales in vitro
Se estudiará actividad antimicrobiana contra Penicillium expansum. Las muestras a analizar serán las siguientes:
a) Propóleo
b) Filtrados obtenidos de cultivo en medio líquido de cepas de Bacillus amyloliquefaciens
c) Extractos de plantas

PROTOCOLO:
En los casos a) y b) se sembrará en forma incorporada en una placa de PDA (10ml) una suspensión de conidias de P. expansum de forma de obtener una concentración de 104 conidias/ml
En el caso a) se prepararán soluciones de propóleo al 1%, 3% y 5% en alcohol 95%. La solución se aplica sobre discos de papel, se deja evaporar el alcohol y se depositan los discos sobre la placa anterior. Como control negativo se coloca un disco impregnado solamente en alcohol 95%, el cual se secó previamente en las mismas condiciones que las soluciones de propóleo.
En el caso b) se colocarán sobre las placas con el medio preparado, reservorios de acero inoxidable estériles de 300 microlitros de capacidad. Dentro de los reservorios se colocarán 200 microlitros de las soluciones a ensayar.
En el caso c) 20 microlitros de los extractos a ensayar se siembran en forma puntual en placas de sílica gel sin indicador de fluorescencia. Se coloca la placa de sílica dentro de una placa de Petri y sobre ella se dispensan 10 ml de PDA fundido inoculado con las conidias de P. expansum.
Las placas se incuban 48 horas a 25ºC.

Se realizarán cromatografías en capa fina de las sustancias anteriormente descritas y sobre la placa corrida se determinará actividad antimicrobiana de igual forma que en el punto c).